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真菌的检验方法

发布日期:2021-04-04 08:04

  1)不染色标本的检查许多真菌标本不需染色即可直接镜检。若发现真菌菌丝和抱子,则可初步判定为真菌感染。如癣病标本多用KOH湿片检查法。即取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上,加1滴10%~20%KOH溶液,然后加盖玻片并微微加热,使标本组织溶解透明,镜检观察线)染色标本的检查标本经染色后镜检既可以更清楚地观察真菌的形态和结构,又可提高检出率。根据菌种和检验要求不同而选用不同的染色方法。常用的真菌染色方法如下。

  (1)革兰染色法:各种真菌均为革兰阳性,为蓝紫色,常用于酵母菌、白假丝酵母菌及组织胞浆菌等的染色。具体染色方法同细菌的革兰染色法。

  (2)乳酸酚棉蓝染色法:适用于各种真菌的直接检查,培养物涂片检查及小培养标本保存等。如皮肤癣菌的检查。取洁净的玻片一块,滴加一滴乳酸酚棉蓝染液,将被检真菌放于染液中,加上盖玻片(加热或不加热)镜检。

  (3)墨汁负染色法:多用于脑脊液标本中新生隐球菌的检查。取一滴优质墨汁置干载玻片上与被检标本混合,盖上盖玻片镜检。

  (4)糖原染色法:又称过碘酸Schiff染色法(简称PAS或PASH)。可用干标本直接涂片及组织病理切片染色检查,其原理是真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成,含有多糖,过碘酸使糖氧化成醛,再与品红-亚硫酸结合,成为红色,故菌体均被染成红色。组织内的糖原亦被染成红色,但因组织内的糖原经淀粉酶消化后消失,此点可鉴别两者。染色方法:①组织切片先用二甲苯脱蜡及95%乙醇逐级脱水,如标本为直接涂片则可从下一步开始;②浸于过碘酸溶液5 min,蒸馏水冲洗2 min;③将标本片再浸入碱性复红溶液中15 min,之后用自来水冲洗直至切片发红;④亮绿复染5 S;⑤ 95%乙醇脱色1次,再用100%乙醇脱色2次,用二甲苯脱色2次;⑥封片,镜检。染色结果:真菌及组织内的多糖成分均呈红色,核为蓝色,背景为淡绿色。

  (5)荧光染色法:染色方法有直接涂片、培养物涂片及组织切片3种。常见深部线常见深部真菌的荧光反应

  (1)阴性结果不能排除真菌感染,故可疑结果应复查或采用其他检验方法鉴定。

  (2)可出现假阳性结果。如溶解的淋巴细胞在脑脊液墨汁负染色检查中易被误认为新生隐球菌;脂肪微滴也可与出芽酵母菌混淆。

  (3)注意与其他混杂物加以区别,真菌抱子、菌丝、菌体都有一定的形态结构,而混杂物形态多样。

  (4)要区分皮肤上的致病菌和腐生菌,腐生菌菌丝不附着在皮肤上而是游离的,菌丝、抱子为棕褐色,菌丝特别粗。

  2.抗原检测采用免疫学方法检测真菌抗原,常用的方法有乳胶凝集试验、ELISA,半定量放射免疫测定法。用乳胶凝集试验检测标本中的白假丝酵母菌甘露聚糖抗原;用乳胶凝集试验和ELISA快速检测患者血清和脑脊液标本中的新生隐球菌荚膜多糖抗原,特别在治疗前检测非常敏感、特异;用半定量放射免疫测定法检测血清、尿液和脑脊液标本中的荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原,可快速诊断。所有检测方法均应设阳性和阴性对照,以防止假阳性和假阴性的发生。

  3.核酸检测随着分子生物学的日益发展,在医学真菌的鉴定手段中不断引入了分子生物学的鉴定方法,从核酸GEC的摩尔分数分析、限制性片段长度多态性分析、Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳分析、PCR指纹分析、随机扩增多态性DNA分析等。分子生物学技术虽具有操作简便、敏感性和特异性高的优点,但需要一定的实验条件,并大多仍处于实验研究阶段,故目前不可能完全替代常规鉴定方法,仅是真菌鉴定的有效补充,尤其对一些疑难、特殊或高度变异的菌种鉴定及深部真菌感染的早期诊断,不失为具有广阔发展前景的诊断新技术。

  1.培养基根据真菌对营养要求的差异及培养目的的不同而选择不同的培养基。常用的线常用的真菌培养基及其用途

  (1)平皿培养:优点是培养基表面积较大,使标本散布,便于观察菌落;缺点是水分易蒸发也易污染。用于培养生长繁殖较快的真菌,如白假丝酵母菌、新生隐球菌等。

  (2)大试管培养:真菌分离培养、传代和保存菌种最常用的方法。优点是水分不易蒸发,可节约培养基及防止污染。用于培养多细胞线)小墙养:常采用载玻片,又称玻片培养,是观察真菌的结构特征及发育全过程的有效方法。方法:①取无菌“V”形玻璃棒放入无菌平皿内;②在“V”形玻璃棒上放一无菌载玻片;③在载玻片上加马铃薯葡萄糖琼脂,并制成约1 cm×1 cm方形琼脂块;④在琼脂块的每一侧用接种针接种待检菌;③将无一菌盖玻片盖在琼脂块上,平皿内放少许无菌蒸馏水,盖好平皿盖,于25~28℃孵育(酵母菌培养1~2日,皮肤癣菌培养1~7日);⑥培养后,取下盖玻片,弃琼脂块干消毒液中,滴加乳酸酚棉蓝染液于载玻片上,再将盖玻片置于载玻片上染色镜检,观察菌丝和袍子此法可用于真菌菌种的鉴定。

  生化反应主要用于深部感染真菌的鉴定二常用的生化反应有糖(醇)发酵试验、糖同化试验、同化氮源试验、明胶液化试验,脲酶试验等。

  1.糖发酵试验常用的糖有浪糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)、双糖(麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖)、三糖(蜜三糖)、多糖(淀粉);醇类有甘油甘露醇山梨醇肌醇等。将它们分别制成糖(醇)发酵管,将线℃孵育一定时间,观察糖发酵情况。

  2.糖同化试验主要用于鉴别酵母菌。将1 mL含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合,然后在培养基上分别加入各种糖少许,置25℃或37℃孵育后观察结果。若24 h后无变化可重复加糖少许。如能同化,在加入糖的周围有真菌的生长圈,否则无生长。一般对双糖发酵的真菌都能同化或利用糖类或醇类。

  3.同化氮源试验用于酵母菌的鉴定。方法与糖同化试验相同,但需用无氮源的培养基,不加糖类,而加入硝酸钾,观察对硝酸钾的利用情况。

  随着高效广谱抗生素的广泛应用、抗肿瘤治疗的深入开展、和外科其他介入性治疗及激素的广泛应用,深部真菌感染的发生呈不断上升趋势,抗真菌药物敏感试验也显得至关重要,并成为指导临床医生用药的手段之一。抗真菌药物敏感试验分为定性试验和定量试验。

  1.临床常用抗线)根据化学结构分类。①多烯类:如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。②吡咯类:如酮康唑伊曲康唑氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。③其他类:如氟胞嘧啶等。

  (2)根据作用机制分类。①作用于真菌细胞膜:如两性霉素B、制霉菌素、氟康唑伊曲康唑伏立康唑酮康唑、克霉唑等:②作用于真菌细胞壁:如尼可霉素Z、卡泊芬净、普拉米星等。③作用干线)根据作用范围分类。①抗浅部真菌药,如灰黄霉素等。②抗深部真菌药,如两性霉素B和制霉菌素等。③广谱抗真菌药,如特比萘芬等。

  2.抗真菌药物药敏试验 按CLS1标准,抗真菌药物敏感试验常用肉汤稀释法,包括常量稀释法和微量稀释法。抗真菌药物敏感试验的设计和操作同抗细菌药物敏感试验。

  一些真菌在生长繁殖过程中可以产生毒素,污染食物后可引起人类真菌中毒症,甚至有的毒素具有致癌性,如黄曲霉毒素与肝癌发生有关;橘青霉素可引起肾脏损害;黄绿青霉素可引起中枢神经系统损害等。真菌毒素的检测方法多样,生物学方法主要用于检测真菌毒素的毒性,如用鸡胚、大白鼠、小白鼠等做毒性试验,观察动物中毒死亡或出现肿瘤;间接竞争ELISA法适用于大批量标本中一黄曲霉毒素Ml的筛选,具有操作简便、安全、快速、高效、费用低等优点,是检测食品的新方法。此外检测黄曲霉毒素ml的方法还有薄层层析法、高效液相色谱法。

  动物实验的目的是分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究药物对线.实验动物的选择与接种途径用干真菌实验的动物有家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠等。不同的真菌标本应选择不同的适宜实验的动物,如假丝酵母菌接种家兔或小白兔等,皮肤癣菌接种豚鼠等。接种的途径有皮肤、皮下、腹腔、静脉、睾丸、颅内等。不同的真菌选择不同的接种途径,如假丝酵母菌进行家兔耳静脉接种,隐球菌进行小白鼠腹腔或颅内接种等。6up

  2.接种方法与结果观察接种标本经无菌盐水混匀后注入实验动物的适宜部位,根据实验动物的大小及接种途径,接种量从0.2~1.0 mL不等。接种后的实验动物应登记编号并分别隔离饲养,每日观察其各项指标(如食欲、体温、脉搏、呼吸、粪便等)的变化,最后进行实验动物的解剖。观察其组织和器官的病理变化,并做直接涂片、分离培养、病理组织切片检查等。

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