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致病性菌检测方法-国家标准

发布日期:2020-11-03 15:22

  致病性菌检测方法-国家标准_生物学_自然科学_专业资料。大肠杆菌检测方法 一、检测流程图 稀释液(1:10)10 ml 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基 44±0.5℃ 24-48 h 不产酸不产气 产酸产气 37℃ 18-24h 划线伊红美蓝

  大肠杆菌检测方法 一、检测流程图 稀释液(1:10)10 ml 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基 44±0.5℃ 24-48 h 不产酸不产气 产酸产气 37℃ 18-24h 划线 h 无典型菌落 *典型菌落 加靛基质试剂 0.5ml 革兰氏镜检 阳性:玫瑰红色 阴性:试剂本色 非阴性短杆菌 阴性短杆菌 粪大肠杆菌 注: (1) 代表非粪大肠杆菌,没必要在进行下一步鉴定。 (2)典型菌落:深紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑湿润,具有金属光泽。也有呈紫黑 色,不带或略带金属光泽,或粉紫色,中心较深的菌落。 二、培养基和试剂 1. 双倍乳糖胆盐培养基(货号:022041,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 60 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 加热搅拌完全溶解, 分装到带有小倒管的试管, 115℃ 高压灭菌 20 min。 2. 伊红美蓝培养基(货号:022060,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 37.5 g,加入蒸馏水或去离子水 1 L,121℃高压灭菌 15 min。 3. 蛋白胨水(货号:022110,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 25 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水,加热搅拌完全溶解,分装到试管,121℃高压灭菌 15 min。 4. 靛基质试剂 柯凡克试剂:5 g 对二甲氨基苯甲醛溶于 75 ml 戊醇,缓慢加入浓盐酸 25 ml。 5. 革兰氏染色 1)染液制备 结晶紫染色液,革兰氏碘液,脱色液(95%乙醇) ,复染液(沙黄复染液/稀石碳酸复红液) 2)染色法 A 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1 min,水洗。 B 滴加革兰氏碘液,作用 1 min,水洗。 C 滴加 95%乙醇脱色,约 30 s,或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂 片,脱色 10 s,水洗。 D 滴加复染液,复燃 1 min,水洗,待干,镜检。 3)染色结果 革兰氏阳性呈紫色,革兰氏阴性呈红色。 铜绿假单胞杆菌检测方法 一、 检测流程图 稀释液 (1: 10) 10 ml 90 ml SCDLP (*增菌培养) 37 ℃,18-24 h 无薄菌膜, 培养液非黄绿色或蓝绿色 薄菌膜,培养液黄绿色或蓝绿色 十六烷基三甲基溴化铵培养基 37 ℃,18-24 h 无典型菌落 *典型菌落 革兰氏染色 *氧化酶试验 *绿脓菌素试验 *硝酸盐还原产气试验 *明胶液化试验 *42℃生长试验 阳 性 阴 性 阴 性 阳性: 粉红色/ 紫红色 阴 性 阳性: 粉 红色/紫 红色 阴 性 无 气 阳性: 产气 阴性: 凝固 不溶 阳性: 粉红色/ 紫红色 阴性: 不生 长 阳性: 生长 : 注: (1) 代表非铜绿假单胞杆菌,没必要在进行下一步鉴定。 (2)典型菌落:扁平无定形,向周边扩散或略有蔓延,表面湿润,菌落呈灰白色,菌落周 围培养基常扩散有水溶性色素。 (3)氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在平皿内,用无菌玻璃棒挑取可疑菌落涂 在滤纸上。滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试剂,在 15s-30s 之内出现粉红色或紫红 色为阳性,阴性不变色。 (4)绿脓菌素试验:取可疑菌落 2-3 个,分别接种在绿脓菌素测定培养基上,置 37℃培养 24h,加入氯仿 3-5ml,充分振荡是培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿内,待提取液为蓝色时, 将其转移到试管并加入 1mol/L 盐酸 1ml,振荡,静置。上层盐酸出现粉红色到紫红色为阳 性。 (5)硝酸盐还原产气试验:取可疑菌落,接种硝酸盐蛋白胨水培养基,37℃培养 24h。小 倒管有气体为阳性。 (6) 明胶液化试验: 取可疑菌落, 穿刺接种在明胶培养基, 37℃培养 24h 后, 放冰箱 10-30min, 阳性呈溶解状,阴性为凝固不溶。 (7)42℃生长实验:取可疑菌落接种普通培养基,41-42℃培养 24-48h,若能生长为阳性, 不生长为阴性。 二、培养基和试剂 1. SCDLP 液体培养基(货号:027010,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 38 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水,加热搅拌完全溶解,分装量 90ml,121℃高压灭菌 20 min。 2. 十六烷基三甲基溴化铵培养基(货号:027040,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 33.3g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 115℃高压灭菌 20 min。 3. 绿脓菌素测定用培养基(货号:027050,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 46.4g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 再加 10g 甘油, 加热搅拌完全溶解, 分装试管,115℃ 高压灭菌 20 min。放置成斜面。 4. 硝酸盐蛋白胨水培养基(货号:027060,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 15.5g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 加热搅拌完全溶解, 分装到带有小倒管的试管, 115℃ 高压灭菌 20 min。 5. 明胶培养基(货号:022250,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 128g 到 1 L 蒸馏水或去离子水,加热搅拌完全溶解,分装试管(60-75mm) , 115℃ 高压灭菌 20 min。垂直放置待其凝固。 6. 营养琼脂培养基(货号:022020,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 33g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 121℃高压灭菌 15 min。 金黄色葡萄球菌检测方法 一、 检测流程图 稀释液 (1: 10) 10 ml 90 ml SCDLP (*增菌培养) 37 ℃,24 h 划线血琼脂平板 无典型菌落 *典型菌落 *革兰氏染色 *甘露醇发酵试验 *血浆凝固酶试验 阴 性 注: (1) 阳性:葡萄状, 无芽孢,无荚 膜,菌体小 无 产 酸 产 酸 无 凝 块 凝 块 代表非金黄色葡萄球菌,没必要在进行下一步鉴定。 (2)典型菌落:金黄色,大而突起,圆形,不透明,表面光滑,周围有溶血圈。 (3) 甘露醇发酵试验: 取可疑菌落, 接种甘露醇培养基, 液面加 2-3mm 灭菌液体石蜡, 37℃ 培养 24h,产酸为阳性。 (4)血浆凝固酶试验:取 1:4 新鲜血浆 0.5ml,置于灭菌小试管,加入待检菌 24h 肉汤培 养物 0.5ml。混匀,放 37℃培养箱,每半小时观察一次,6h 内出现凝块,则为阳性。同时要 做阳性和阴性菌株肉汤培养物对照实验。 二、培养基和试剂 1. SCDLP 液体培养基(货号:027010,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 38 g 到 1 L 蒸馏水或去离子水,加热搅拌完全溶解,分装量 90ml,121℃高压灭菌 20 min。 2. 血琼脂培养基(货号:024060,厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 40g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 121℃高压灭菌 15 min。使用时每 100ml 培养基加 入无菌脱纤维羊血或兔血 5-10ml,要匀倒平皿。 3. 甘露醇发酵培养基(货号:024030,6up。厂家:广东环凯微生物科技有限公司) 称取 30g 到 1 L 蒸馏水或去离子水, 加热搅拌完全溶解, 分装试管,115℃高压灭菌 20 min。

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