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临床微生物学检验 细菌耐药性检测ppt

发布日期:2020-07-17 02:33

  耐甲氧西林葡萄球菌的检测 MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。 头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。 对于金黄色葡萄球菌,MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片,但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。 * * MRS的检测:纸片法、盐琼脂筛选法 * * * * MRS检测 药物 纸片法 稀释法 金黄色葡萄球菌 1mg 苯唑西林 √ √ 路邓葡萄球菌 1mg 苯唑西林 × √ 金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌 30mg 头孢西丁 √ √ 除路邓以外的凝固酶阴性葡萄球菌 1mg 苯唑西林 × √ 30mg 头孢西丁 √ × 检测MRS方法及选择 克林霉素诱导耐药葡萄球菌 红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。 *或其他大环内酯类 红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制 机制 耐药基因 红霉素 克林霉素 核糖体修饰-药物不能结合于靶位 erm R S* R R 结构性 泵-药物被泵出 msrA R S erm = erythromycin ribosome methylase msrA = macrolide streptogramin resistance *需要诱导来显示耐药性 * * 对于红霉素耐药、克林霉素敏感的葡萄球菌,需检测诱导性克林霉素耐药 注意 试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株); 对于CONS,该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌; 大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的; 大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型); 克林霉素可以口服给药。 (1)将待检菌按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 (2)在M-H平上板贴一片红霉素 (15ug/片) 纸片,在距纸片边缘1.5cm处贴克林霉素 (2ug/片) 纸片。 (3)35℃孵育18-24h,如克林霉素出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。 葡萄球菌-“D试验” 葡萄球菌-“D试验” 患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药 无克林霉素诱导(msrA介导) 真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感 “D” 阳性 阴性 15 ~ 26 mm * * 4.0 μg/ml 红霉素 0.5 μg/ml 克林霉素 No growth = 无诱导性克林霉素耐药 生长=诱导性克林霉素耐药 葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法 * * * * * 临床上常见的耐药菌 临床上常见的耐药菌 临床上常见的耐药菌及结果的修正和解读 临床上常见的耐药菌及结果的修正和解读 临床上常见的耐药菌及结果的修正和解读 细菌的耐药性和产生机制 细菌的耐药性:天然耐药、获得性耐药 细菌获得性耐药产生的机制: 1、产生水解酶、修饰酶 β-内酰胺酶的产生(水解酶) 修饰酶等的产生(氨基糖甙类修饰酶 氯霉素乙酰转移酶、 红霉素酶和其他灭活酶) 2、药物作用靶位的改变(PBP、核糖体等) 3、抗菌药物渗透障碍(外膜孔蛋白减少、生物膜 的形成) 4、药物泵出(主动外排泵) 细菌的耐药性的检测方法 一、耐药性表型检测 1、β-内酰胺酶检测 2、超广谱β内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs) 、AmpC酶、碳青霉烯酶的检测 3、MRS的检测 4、D试验-可诱导的克林霉素耐药试验 5、氨基糖苷类高水平耐药和万古霉素耐药肠球菌的检测 二、耐药基因检测:PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP 、DNA测序等 β-内酰胺酶 β内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶;该酶位于革兰阳性球菌菌体外,革兰阴性杆菌间质中。常见有广谱酶、超广谱β内酰胺酶、金属酶、AmpC酶等。 检测方法有微生物培养法、碘-淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速,应用于临床检测。 (1)头孢硝基噻吩显色法(Nitrocefin):制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上,10min观察纸片颜色,显红色为阳性(葡萄球菌应放置1h内观察)。简单、方便、快速,应用于临床检测。 (2)酸度法:青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚红指示剂由红色(构橼酸钠缓冲液pH8.5)变为黄色。 (3)碘测定法:β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环,碘与破坏后的β-内酰胺结合,使兰色的淀粉—碘复合物转变成无色。 (4)仪器测定法:Vitek、Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能。 β-内酰胺酶的检测 * * 头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶 (nitrocefin test) (+) 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环?内酰胺类氨曲南的一类酶; ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物,能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等?内酰胺酶抑制剂所抑制; ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。 (1)纸片扩散初筛:头孢他啶(30μg/片)抑菌圈≤22mm 头孢噻肟(30μg/片)抑菌圈≤27mm 头孢曲松(30μg/片)抑菌圈≤25mm 氨曲南(30μg/片)抑菌圈≤27mm (2)双纸片协同确认试验: 头孢他啶(30μg/片)与头孢他啶(30μg)/克位维酸(10μg) 头孢噻肟(30μg/片)与头孢噻肟(30μg)/克拉维酸(10μg)两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。 ESBLS的检测 * * 纸片扩散法检测ESBLS: 项 目 初步筛选试验 表型确证试验 培养基 MH琼脂 MH琼脂 抗生素纸片浓度 头孢泊肟10?g 头孢他啶30?g 头孢他啶30?g 头孢他啶/棒酸30/10?g 氨曲南30?g 和 头孢噻肟30?g 头孢噻肟30?g 头孢曲松30?g 头孢噻肟/棒酸30/10?g 接种 按标准纸片扩散法的规定进行 孵育条件 35?C, 空气 孵育时间 16~18h 结果判读 头孢泊肟?17mm 对2个中任何一个药 头孢他啶?22mm 物,加棒酸后,抑菌环直 氨曲南?27mm 径与不加棒酸的抑菌 头孢噻肟?27mm 环相比,增大值?5mm 头孢曲松?25mm 时,判定为ESBL产生 意味着可疑有ESBL ? * * ESBLs初筛和确证试验 双纸片协同试验初筛ESBLs 表型确证试验检测ESBLs ESBLs初筛试验 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) (3)稀释法,出现以下一种情况即可怀疑该菌 株产生ESBLs: 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC≥2mg /mL 或头孢泊肟MIC≥8mg /mL (4)E-test法(浓度梯度法):由瑞典AB Biodisk公司研究生产,广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为ESBLS。 (5)仪器测定法:Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。 (6)利用分子生物学技术(PCR、DNA探针等)及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。 ESBLS的检测 * * 检测ESBLs 碳青霉烯酶 碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的β-内酰胺酶,主要分布于β-内酰胺酶A、B、D类中。 根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类: 一类称为金属碳青霉烯酶,这类酶以金属锌离子为活性作用位点,可以被EDTA抑制,属于B类β-内酰胺酶; 另一类以丝氨酸(Ser)为酶的活性作用位点,百家乐技巧,可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制,属于A、D类β-内酰胺酶。 * * 碳青霉烯酶 A类酶 B类酶 D类酶 染色体编码:SME NMC IMI 质粒编码:KPC GES 质粒编码 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OXA-60 OXA-62 金属酶,位于GMEs上,包括VIM,IMP,GIM,SPM,SIM等 可以被酶抑制剂抑制 可以被EDTA抑制 碳青霉烯酶表型检测方法-改良hodge试验 ATCC25922,0.5麦氏,1:10稀释涂MH平板 平皿中心贴10μg 厄他培南或亚胺培南纸片 10μl环挑取3-5个被测菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线 被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922 抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强,即产碳青霉烯酶。 改良hodge试验的结果判读 金属酶表型检测方法:EDTA协同试验 用0.5麦氏单位的待测菌悬液涂布M H 平板。 贴IMP (10μg)纸片.距其1cm 处贴EDTA纸片(0.5mol/L 4μl)。 35℃ 过夜培养。 亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌株。 亚胺培南 EDTA 10mm 1.初筛: (1)头孢西汀(30μg/片)与头孢西汀(30μg)/邻氯西林(200μg)。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。 (2)5种纸片筛选:马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀≤18mm,对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc,如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS。 2.确认试验(头孢西汀三维水相试验法) Ampc酶检测 * * 何为MRS? ? * * MRS:即对甲氧西林或苯唑西林或头孢西丁耐 药的葡萄球菌。 包 括: MRSA(methicillin resistant staphylococci) MRCNS(methcillin resistant coagulase negative staphylococci) * * 特点:MRS对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药,常表现为多重耐药。 MRS耐药机制 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)携带SCCmec基因盒,SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a,这种蛋白对甲氧西林和其他的β-内酰胺类抗生素亲和力下降,从而导致对这些抗生素的耐药。 SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不同mec复合物和ccr复合物的组合,可以将SCCmec分成不同的型别,目前已发现8种SCCmec型。 * * 苯唑西林纸片法判断标准: MRSA:苯唑西林纸片抑菌环直径≤10mm MRCNS:苯唑西林纸片抑菌环直径≤17mm 头孢西丁纸片法判断标准: MRSA和MRSL:头孢西丁纸片抑菌环直径≤21mm MRSCNS(除路邓葡萄球菌):头孢西丁抑菌环直径≤24mm 盐琼脂筛选试验法判断标准: 点种细菌处出现一个以上的菌落判断为MRS 纸片扩散法的步骤 水解酪蛋白(MH)培养基,pH7.2~7.4,制备成琼脂厚度4mm,直径90mm的平板; 挑取孵育16 ~ 24小时已分纯菌落,置于生理盐水管中,振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。 纸片扩散法的步骤 用无菌棉拭子蘸取菌液,在试管内壁旋转挤去多余菌液; 然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板60度; 最后沿平板内缘涂抹1周; 平板在室温下干燥3~5min,用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心距离应大于24mm,纸片距平板内缘大于15mm。 纸片扩散法的步骤 35℃孵育16~24小时量取抑菌圈直径; 根据抑菌环的直径,按照CLSI标准判读,报告敏感、中介、耐药。 * * * * * * * * 纸片扩散法影响因素 接种菌量 纸片抗菌药物含量、有效性 培养基成分、琼脂的厚度 孵育温度、时间 操作因素等 纸片扩散法材料与判断 抗菌药物纸片:直径6.0--6.35mm,吸水量为 20μl的滤纸。 培 养 基:MH琼脂,pH7.2--7.4,琼脂 厚度4mm 菌液浓度和接种:0.5麦氏浊度,15min内接 种完毕。 结果判断与报告:S(敏感)、I(中介)、 R(耐药) 质 控:采用标准菌株进行 药敏质控。 * * 质量控制:采用质控菌株 肠杆菌科细菌:大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌:大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌ATCC27853 不 动 杆 菌 等: 大肠埃希菌ATCC25922 ATCC35218 铜绿假单胞菌ATCC27853 葡 萄 球 菌 属:金黄色葡萄球菌ATCC25923 大肠埃希菌ATCC35218 肠 球 菌 属:粪肠球菌ATCC29212 纸片扩散法 稀释法 1.肉汤稀释法 用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释后,再接种待测菌,定量测定抗菌药物抑制或杀灭待测细菌的最低抑菌浓度( minimal inhibitory concentration , MIC)或最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC)。 稀释法—肉汤稀释法 培养基:CLSI推荐调节了钙离子浓度的MH肉汤,pH 7.2--7.4 药物稀释: 药物原液:用直接购于药厂的高纯度药粉配置,浓度不低于1000μg/ml或10倍于最高测试浓度,-60℃储存,不超过6个月 稀 释 液:蒸馏水、磷酸盐缓冲液、NS等 药物的稀释:2倍稀释 菌种终浓度:5×105 CFU/ml(用0.5麦氏浊度菌液稀释) 结果判断:在试管或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。 * * 抗生素2倍系列稀释 滴加定量菌液 * * 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 * * 稀释法 2.琼脂稀释法 将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培养基中,配制出含各种浓度药物的平板,使用微量多头接种器接种细菌,孵育后观察细菌在含不同浓度药物的平板上的生长情况,以抑制细菌生长的平板所含的药物浓度测得最低抑菌浓度(MIC) 稀释法—琼脂稀释法 培养基:MH琼脂,pH7.2~7.4 含药琼脂的配制:药物溶液与培养基的比为1:9,琼脂厚度3-4mm 菌液浓度:0.5麦氏浊度菌液稀释10倍,多头接种器接种(每接种点1-2μl)。 结果判断:MIC,MIC50、MIC90 * * 被测菌在含定量药物的琼脂上生长 了解两个概念 抑制50%试验菌株的 最低药物浓度。 MIC90: MIC50: 抑制90%试验菌株的 最低药物浓度。 * * * 药物浓度 4 8 16 32 64 ug/ml 制备含对倍抗生素浓度梯度的平板,制备菌悬液, 点种菌,104CFU/每个点,孵育,判读结果 琼 脂 稀 释 法 琼脂稀释法优缺点 金标准 精确可靠 可同时测定多株菌(60株) 细菌生长情况可查 优点 缺点 测多个药时劳动强度大 制备平皿费时费力 E 试验(Epsilometer test) 是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技术。 原理:E试条是一种宽5mm、长50mm的商品化塑料试条,一面固定有干化、稳定的、浓度呈连续指数分布的抗菌药物,另一面有药物的浓度刻度读数(μg/ml)。抗菌药物梯度范围一般为15-20个自然对数。 * * E试验原理 (MIC,μg/ml) * * * * 细菌的接种和加样:同K-B法 厚度4mm的MH平板,用0.5麦氏浊度的菌液涂布接种,直径9cm的平板可放两条药敏试验条。 结果判断与报告: E-test法优缺点 连续浓度梯度,与琼脂稀释法相关性好 影响因素少,稳定性高 操作简单,省时 优点 缺点 昂贵 用途:快生长菌,苛养菌,厌氧菌,酵母菌,分枝杆菌 联合药敏试验 一、棋盘稀释法联合药敏试验(定量) 二、联合药敏实验结果: 1、无关作用(联合活性等于单独活性) 3、累加作用:联合活性等于单独活性相加。 4、协同作用:联合活性显著大于单独活性的总和 2、拮抗作用(联合活性低于单独活性) 自动化仪器检测 细菌的天然耐药 有些菌属或者菌种对某些抗菌药物天然耐药或者固有耐药,该耐药性具有种属特异性 1)肠球菌属:对除青霉素,氨苄西林外的所有青霉素类,头孢菌素类抗生素天然耐药 2)嗜麦芽窄食单胞菌:亚胺培南,美罗培南 3)肺炎链球菌:氨基糖苷类 4)产期肠杆菌和阴沟肠杆菌:头孢西丁 5)克柔念珠菌:复康唑 6)肺炎克雷伯菌:氨苄西林 7)铜绿假单胞菌:氨苄西林,阿莫西林,复方新诺明,头 孢一代,头孢二代 细菌的耐药性和产生机制 细菌的耐药性:天然耐药、获得性耐药 细菌获得性耐药产生的机制: 1、产生水解酶、修饰酶 β-内酰胺酶的产生(水解酶) 修饰酶等的产生(氨基糖甙类修饰酶 氯霉素乙酰转移酶、 红霉素酶和其他灭活酶) 2、药物作用靶位的改变(PBP、核糖体等) 3、抗菌药物渗透障碍(外膜孔蛋白减少、生物膜 的形成) 4、药物泵出(主动外排泵) 临床上常见的耐药菌 MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 VRSA:耐万古霉素金黄色葡萄球菌 VRE:耐万古霉素肠球菌 ESBLs:超光谱?内酰胺酶 KPC酶:产碳青烯酶的一种KPC型 临床上常见的耐药菌 Penicillins种类和抗菌活性 脲基组 :对铜绿假单胞菌有抑制作用, 包括美洛西林(mezlocillin)、阿洛西林(azlocillin)和哌拉西林(piperacillin)。 头孢菌素类(cephalosporins)抗生素 是一类广谱半合成抗生素,具有抗菌作用强、耐青霉素酶、临床疗效好、毒性低、过敏反应较青霉素类少见等优点。 根据抗菌谱、对β内酰胺酶的稳定性以及发现时间的先后将其分为五代。 抗菌作用 G+菌 G-菌 1st gen. cephalosporin + - 2nd gen. cephalosporin 3rd gen. cephalosporin - 4th gen. Cephalosporin + + 5th gen. Cephalosporin + + Cephalosporins种类及抗菌活性 1st generation 对革兰阳性菌有较强的作用,包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、厌氧链球菌,但对耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)、肠球菌、耐青霉素的肺炎链球菌耐药。 对革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌中度敏感,对假单胞菌、变形杆菌、沙雷菌和肠杆菌属耐药。 作用菌 头孢噻啶(cephaloridine,先锋2号)头孢噻吩(cephalothin,先锋1号) 头孢氨苄(cephalexin,先锋4号) 头孢唑啉(cefazolin,先锋5号) 头孢拉啶(cephradine, 先锋6号) 头孢匹林(cephaprin, 先锋8号) 头孢羟氨苄(cefadroxil) 药名 Cephalosporins种类及抗菌活性 2nd generation 对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌(包括耐氨苄西林菌株)活性强 。 多孢孟多(cefamandole) 头孢呋辛(cefuroxime,zinacef,西力欣)、头孢尼西(cefonicid) 头孢雷特(ceforanide) 头孢克洛(Cefaclor,头孢氯氨苄) 头孢丙烯(Cefprozil) 作用菌 药名 Cephalosporins种类及抗菌活性 3rd generation 对革兰阴性肠杆菌科和铜绿假单胞菌具有强大的抗菌活性 ;对第一、二代头孢菌素耐药的革兰阴性菌敏感 ;第三代口服头孢菌素对革兰阴性及阳性菌具有更广谱的抗菌活性,但所有口服药对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无抗菌活性 。 注射用: 头孢噻肟 (cefotaxime,claforan,凯复隆)头孢曲松(ceftriaxone,头孢三嗪,菌必治)、头孢唑肟(ceftizoxime,epocelin) 头孢他啶(ceftazidime,fortum,复达欣) 头孢哌酮(cefoperazone,Cefobid,先锋必) 口服用: 头孢克肟(cefixime) 头孢布坦(ceftibuten) 头孢迪尼(cefdinir) 头孢泊肟(cefpodoxime) 作用菌 药名 Cephalosporins种类及抗菌活性 4th generation 对葡萄球菌抗菌活性强,对产ESBL和AmpC酶的革兰阴性菌效果好。 头孢匹罗(cefpirome) 头孢匹美(cefepime) (又称头孢吡肟) 和cefclidin 作用菌 药名 Cephalosporins种类及抗菌活性 5th generation 对MRSA在内的G+具有强大的抗菌作用,同时保持了与最近几代头孢菌素相当的抗G-的活性 头孢洛林(cefpirome) 作用菌 药名 β内酰胺酶抑制剂 作用:能抑制β内酰胺酶的活性,与β内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。 种类:主要有舒巴坦(sulbactam)、克拉维酸(clavulanic)、三(他)唑巴坦(tazobactam)。 β内酰胺酶抑制剂复合制剂 青霉素+?-内酰胺抑制剂 :作用于产?-内酰胺酶的革兰阴性和阳性细菌。包括: ① 氨苄西林-舒巴坦ampicillin-sulbactam(unasyn); ②替卡西林-克拉维酸(即替美丁)ticacillin-clavulanate(Timentin); ③阿莫西林-克拉维酸(即安美汀)amoxicillin-clavulanate(Augmentin); ④哌拉西林-他唑巴坦 piperacillin-tazobactam。 氨基糖苷类(aminoglycosides) 作用机制:作用于细菌体内的核糖体30S小亚基,抑制细菌蛋白质的合成,并破坏细菌细胞膜的完整性。对静止期细菌的杀灭作用较强,是一静止期杀菌剂。 种类:链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那、奈替米星等 副作用:肾毒性和耳毒性 抗菌谱:主要为革兰阴性杆菌,链球菌和肠球菌对其天然耐药。 大环内酯类(macrolides) 作用机制:作用于细菌核糖体50S大亚基,通过阻断转肽作用和mRNA位移而抑制细菌蛋白质合成。 种类:红霉素,乙酰螺旋霉素,罗红霉素等 不良反应:主要不良反应为胃肠道反应。 抗菌谱:革兰阳性菌和少数革兰阴性菌,对支原体、衣原体、螺旋体等有良好的作用。 四环素类(tetracyclines) 作用机制:药物与细菌体内30S核糖体亚单位在A位上特异性结合,阻止氨基酰-tRNA与mRNA核糖体的受位位点结合,从而抑制肽链延长和蛋白质合成。此外,药物可引起细菌细胞膜通透性的改变,使胞内的核苷酸和其他重要成分外漏,迅速抑制DNA的复制。 种类:四环素,土霉素,多西环素,米诺环素等 副作用:胃肠道反应,对儿童的牙齿和骨骼的发育有影响。 抗菌谱:对革兰阳性菌的作用优于革兰阴性菌,对支原体、衣原体、立克次体、螺旋体等有效。肠球菌耐药。 作用机制:作用于细菌70S核糖体的50S亚基,抑制转肽酶,使肽链的伸长受阻,从而抑制菌体蛋白的合成。 抗菌谱:广谱抑菌剂,对革兰阴性菌的作用较革兰阳性菌强。 副作用:骨髓抑制、再生障碍性贫血等等 氯霉素类(chloramphenicols) 抗菌机制:拮抗细菌的DNA旋转酶,从而阻断细菌DNA的复制而产生快速杀菌作用。 种类:临床上常用的为氟喹诺酮类药物 抗菌谱:革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌 不良反应:主要为消化道反应,其次是神经系统反应。 喹诺酮类(quinolones) 临床常用抗菌药物 临床常用抗菌药物 β-内酰胺类抗菌药物 氨基糖甙类抗菌药物 大环内酯类抗菌药物 四环素类抗菌药物 氯霉素类抗菌药物 林可酰胺类抗菌药物(作用机制似红霉素) 糖肽类抗生素(万古霉素等) 喹诺酮类抗菌药物 磺胺类抗生素(干扰叶酸合成,核酸合成受抑) 呋喃类抗生素(干扰氧化还原酶系统,代谢阻断) 抗菌药物敏感性实验 (antimicrobial susceptibility test,AST) 目的: 1.预测抗菌治疗效果(S、R、I) 2.指导抗菌药物的临床应用 3.发现或提示细菌耐药机制的存在 4.监测细菌耐药性、分析其变迁 如何进行抗菌药物选择? 我国根据美国NCCLS(National committee for clinical laboratory standards,NCCLS), 2005年后称CLSI(Clinical and laboratory standards institute)制定的标准进行。 CLSI将抗菌药物的选择分成五组: A组:对特定菌群常规测试并常规报告的抗菌药物。 B组:对于临床重要的,特别是针对医院感染的药物,常规测试但选择性报告的抗菌药物。 抗菌药物的选择 对A组药物过敏、耐受或无效的菌株。 特定标本来源的菌种:如脑脊液中肠杆菌科细菌报告对三代头孢的敏感性,对泌尿道的分离肠杆菌株报告TMP/SMZ结果。 多种细菌感染。 不同病原菌多部位感染。 为流行病学调查目的向感染控制组报告。 B组药物报告指征 抗菌药物的选择 C组:替代或补充性抗菌药物,选择性报告的药物。 可以在以下情况下进行C组药物试验: 对基本(A、B组)药物耐药或过敏的菌株 少见菌的感染 为流行病学目的向感染控制组报告。 抗菌药物的选择 U组:仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。 除泌尿道,其他感染部位分离出的病原菌不用此组药物。 O组(Other):对检测菌有临床指征、但一般不允许常规试验和报告的药物。 Inv组(Investigational):做研究用但尚未得到FDA批准的药物。 抗菌药物的选择 抗菌药物的选择 * * * * 临床常用抗菌药物 药敏结果的判断? 依据CLSI的标准进行判断 药物常规用量治疗有效 即抗菌药物在患者感染部位通常所能达到的浓 度可抑制分离菌株的生长。 药物常规用量无效 即抗菌药物在患者感染部位通常所能达到的浓 度不能抑制分离菌株的生长。 敏感(Susceptible) 耐药(Resistance) 结果判断(CLSI的定义) 抗菌药物在生理浓集的部位具有临床效力 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效 缓冲区:防止操作的系统误差造成重大 结果的判定错误 中介 (Intermediate) 结果判断(CLSI的定义) 药敏试验常用的方法 纸片扩散法(Disk diffusion) 稀释法(Dilution Test) 肉汤稀释法(常量法和微量法) 琼脂稀释法 E试验 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上 纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度 在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度并与该药对测试菌的 MIC 呈负相关关系 纸片扩散法(K-B 法)原理 * * 涂布接种细菌 * * 医科大学金域检验学院临床微生物检验教研室 细菌耐药性 * 抗生素的给人类带来的福与祸 福 抗生素的使用使全人类的平均寿命增加了10岁。 祸 细菌耐药严重 出现超级细菌 合理使用抗生素!!! * 主要内容 2 抗菌药物敏感试验 1 临床常用抗菌药物种类和作用 3 细菌耐药机制 细菌耐药检测 4 3 思考题 1.beta内酰胺类抗生素有哪些?其抗菌机理是什么? 2.氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和氯霉素抗生素抗菌机理 3.抗生素敏感试验中B组药物在何种情况下可以选用? 4.纸片扩散法(K-B)药敏实验的原理和影响因素? 5.药敏实验结果为S、I、R的意义是什么? 6.何为MIC?何为E实验? 7. 联合药敏实验结果为拮抗作用、无关作用、累加作用和协同作用的意义分别是什么? 思考题 12.K-B法药敏试验所用的培养基是什么?接种的菌液浓度一般为多少?培养基的厚度、pH一般为多少? 13.肉汤稀释法药敏试验所用的培养基是什么?接种细菌的终浓度一般为多少?肠杆菌科细菌药敏检测的质控菌株是什么? 14. 琼脂稀释法所用的的培养基是什么?接种的菌液浓度一般为多少?培养基的厚度、pH一般为多少? 15.何为MIC50和MIC90? * 抗菌药物发现史上几个重要的里程碑 德国药物学家Domagk发现百浪多息--第一个合成 的磺胺类药物,使现代医学进入化疗新时代。 英国细菌学家Fleming发现微生物的拮抗作用, 20世纪医学界最伟大的创举。 1929年 1932年 * * 抗生素时代的开创——青霉素的发现 抗菌药物发现史上几个重要的里程碑 Chain和Florey接受美国政府的邀请,进行青霉素的 研究开发,发明可供人体注射用的青霉素,开创了 化疗新时代。 美国科学家Waksman发现链霉素,奠定了从微生物 代谢产物中寻找抗生素的基础,造就了抗生素发展 的黄金时代。 1940年 1942年 临床常用抗菌药物 抗菌药物发现史上几个重要的里程碑 Batchelor和1961年Abraham等分别分离出青霉素母核 6-APA(6-氨基青霉烷酸)和头孢菌素母核7-ACA (7-氨基头孢烷酸),开创了半合成β-内酰胺类抗生素 的新时代。 应用微生物筛选和青霉素结构改造获得β-内酰胺酶抑制剂, 有效地控制了产酶菌引起的感染。 1959年 1973年 临床常用抗菌药物 临床常用抗菌药物 β-内酰胺类抗菌药物 氨基糖甙类抗菌药物 大环内酯类抗菌药物 四环素类抗菌药物 氯霉素类抗菌药物 林可酰胺类抗菌药物(作用机制似红霉素) 糖肽类抗生素(万古霉素等) 喹诺酮类抗菌药物 磺胺类抗生素(干扰叶酸合成,核酸合成受抑) 呋喃类抗生素(干扰氧化还原酶系统,代谢阻断) Beta-内酰胺类抗菌药物 概念:化学结构式中具有内酰胺环的一大类抗生素。 临床常用抗菌药物 抗菌作用靶位 存在于所有细菌细胞膜的表面,在细菌细胞壁合成中主要起各种细胞壁合成酶(转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶等)的作用,均是?-内酰胺类抗生素潜在的靶标。 其数量、分子大小及与?-内酰胺类抗生素的亲和力随细菌种类不同而不同。 青霉素结合蛋白(penicillins binding proteins, PBPs) 临床常用抗菌药物 Beta-内酰胺类抗菌药物 与青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)结合,抑制PBPs(有转肽酶等酶的作用)活性作用,进而抑制细菌细胞壁的合成。繁殖期杀菌 抗菌作用机制 β内酰胺类抗菌药物作用机制 * * Beta-内酰胺类抗菌药物 青霉素类 头孢菌素类 头霉素类 单环内酰胺类(monobactams) 碳青霉烯类抗生素(carbapenems) β内酰胺酶抑制剂 种 类 青霉素类(Penicillins)抗生素 四个原子的? -内酰胺环和五个原子噻唑环 引入不用的基团有不同的效应 有天然青霉素、耐酶青霉素、广谱(氨基组、羧基组、脲基组)青霉素 Penicillins种类和抗菌活性 耐青霉素酶青霉素 甲氧西林 methicillin 苯唑西林 oxacillin 氯唑西林 cloxacillin等 天然青霉素: 青霉素G、青霉素V(不稳定) 作用于不产青霉素酶的革兰阳性球菌、革兰阴性菌和厌氧性细菌。 Penicillins种类和抗菌活性 氨基组:作用于青霉素敏感菌,大部分大肠埃希菌,奇异变形杆菌,流感嗜血杆菌。包括氨苄西林(ampcillin)、阿莫西林(amoxicillin) 。 羧基组:作用于产?-内酰胺酶 肠杆菌科和假单胞菌 ,对氨苄西林无效的革兰阴性杆菌 ,协同氨基糖苷类抗生素对肠球菌抑菌作用,包括羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin) 广谱青霉素 * * * * *

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