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6up细菌检测方法研究进展

发布日期:2021-02-05 07:19

  细菌检测方法研究进展_生物学_自然科学_专业资料。细菌检测方法研究进展 Contents 1 细菌传统检测方法 2 细菌免疫学检测方法 3 细菌分子生物学检测技术 4 展望 随着现代科学技术的不断发展,特别是免疫学、生物化 学、

  细菌检测方法研究进展 Contents 1 细菌传统检测方法 2 细菌免疫学检测方法 3 细菌分子生物学检测技术 4 展望 随着现代科学技术的不断发展,特别是免疫学、生物化 学、分子生物学的不断发展,新的细菌检测技术和方法 已广泛用于病原微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养 及生化反应,已远远不能满足对各种病原微生物的检测 以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力,已 创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌 学检测方法,尤其分子检测技术的发展和应用,明显提 高了细菌的检测水平。 1 细菌传统培养检测方法 1.1 分离培养检测及鉴定方法 食品中病原菌的传统检测方法是将分离培养后的 可疑菌落做涂片染色实验、生化反应实验、溶血 实验、协同溶血实验(CAMP)、动物实验及典型 运动等鉴定等。 1 细菌传统培养检测方法 1.2 显色培养基快速检测技术 显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶 与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物的 新型培养基。 它是一种新型分离培养基,利用显色培养基进行 微生物的筛选分离,其反应的灵敏度和特异性大 大优于传统培养基。 1 细菌传统培养检测方法 1.2 显色培养基快速检测技术 例:大肠杆菌/大肠菌群显色培养基:用于食品、水、牛 奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。 大肠杆菌显蓝色至紫色,大肠菌群显红色。 1 细菌传统培养检测方法 1.3 API生化鉴定系统 主要依据API试剂条的生化反应结果将一种/组细 菌与其它细菌相鉴别,并用%id(鉴定百分率)表示 每种细菌的可能。各类API试剂条均由多个生化反 应组成,编码即是将生化反应谱转换成数码谱,以 便于使用生化反应检索手册或API电脑分析软件进 行检索,确定生化反应谱对应的是什么细菌。 1 细菌传统培养检测方法 1.3 API生化鉴定系统 API(Analytic Products INC)系统用于细菌鉴定的 品种有15种,分别有相应的数据库。数据库由细菌 条目(taxa)组成,每个条目可能因情况的不同代表 细菌种、细菌的生物型、细菌的菌属。 2 细菌免疫学检测方法 2.1 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体 金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记 技术。 2 细菌免疫学检测方法 2.2 免疫层析技术 免疫层析技术一种将免疫技术和色谱层析技术相 结合的快速免疫分析方法。原理是将特异的抗体 先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的 硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由 于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移 动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即 与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免 疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现 特异性的免疫检测。 2 细菌免疫学检测方法 2.3 纳米免疫磁珠技术 纳米免疫磁珠技术是以抗体包被纳米磁珠的为载 体,通过抗体与反应介质中特异性抗原结合。本 方法最大程度地提高该致病菌的检出率及灵敏度, 在24h能够检出病原菌。 2 细菌免疫学检测方法 2.4 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(ELISA)是根据抗原或抗体特异 性免疫反应原理设计,将己知的抗原或抗体结合 在某种固相载体上,以辣根过氧化酶(HRP)为指示 剂,标记在另一种抗原或抗体上,加入酶作用底 物,酶与底物发生反应后,底物显色,根据底物 显色的深浅定性或定量地检测样本中的抗体或抗 原。 2 细菌免疫学检测方法 2.4 酶联免疫吸附试验 应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪,是 用荧光分析技术通过固相吸附器,用已知抗体来捕捉目标 生物体,然后以带荧光的酶联抗体再次结合,经充分冲洗, 通过激发光源检测,即能自动读出发光的阳性标本,其优 点是检测灵敏度高,速度快,可以在48小时的时间内快速 检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌,空肠 弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。 2 细菌免疫学检测方法 2.5 乳胶凝集实验(LAT) LAT是以乳胶颗粒作为载体的一种间接的凝集试 验。利用人工大分子乳胶颗粒抗体,吸附可溶性 抗原于其表面发生肉眼可见的凝集反应,以达到 检测目标细菌的目的。乳胶凝集试验由于具有快 速敏感、简单易行、无需昂贵仪器等优点,已广 泛用于多种病原菌的检测以及流行病学调查中。 2 细菌免疫学检测方法 2.6 免疫印迹法(Western blot) 免疫印迹法又称为蛋白质印迹法,是根据抗原抗 体的特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法。 它综合了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性,是 一种有效的分析手段,广泛应用于细菌的检测中, 但该方法操作复杂,耗时费力。 2 细菌免疫学检测方法 2.6 免疫印迹法(Western blot) 3 细菌分子生物学检测技术 3.1 核酸探针检测技术 根据完成杂交反应所处介质的不同,分成固相杂 交反应和液相杂交反应。 固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应, 如常见的印迹法和菌落杂交法。 液相杂交法指杂交反应在液相中完成,不需固相 支持,优点是杂交速度比固相杂交反应速度快。 缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入 反应体系中的干扰剂。 3 细菌分子生物学检测技术 3.2 PCR检测技术 聚合酶链反应(PCR)是一种体外扩增DNA技术。当存在模 板DNA、底物、上下游引物和耐热DNA聚合酶时,经过 多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程,模板DNA就可 得到大量扩增。 3 细菌分子生物学检测技术 3.2 PCR检测技术 实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学 物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方 法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进 行定量分析的方法。 Ct值(Cycle threshold,循环阈值) 的含义为:每个反应管内的荧光信号到 达设定阈值时所经历的循环数 3 细菌分子生物学检测技术 3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法 原理:针对靶基因的特定区域设计1种特异的引物, 利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymcrasc) 在65℃左右恒温保存几十分钟,即可完成核酸扩 增反应,且1h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程 不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分 子的影响较小。同时,在等温条件下扩增,不会 因温度的改变而造成时间损失,并且模板也不需 要进行热变性,从而保证了LAMP扩增的高效特异 性。 3 细菌分子生物学检测技术 3.3 DNA环介导恒温核酸扩增法 DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、 基于酶反应的,可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸 扩增方法,具有高特异性和等温快速扩增的特点。 例:志贺菌检测 3 细菌分子生物学检测技术 3.4 CRISPR检测 近来研究发现成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR)广泛分 布于细菌和古细菌中。 CRISPR主要由重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)间隔排列 构成的R-S结构组成,其与CRISPR相关蛋白基因(CRIPSPR associated,cas)组成CRISPR /cas系统,为原核生物提供对 噬菌体、质粒等外源基因的获得性免疫能力,从而抵抗噬 菌体感染,限制基因的水平转移(HGT)。 3 细菌分子生物学检测技术 3.4 CRISPR检测 例:志贺菌CRISPR的检测 3 细菌分子生物学检测技术 3.5 DiversiLab系统 DiversiLab系统是基于重复序列聚合酶链反应(repPCR)技术原理的半自动基因分型方法,通过PCR 扩增细菌基因组的非编码重复序列后根据扩增片 段的多态性比较菌株间相似性,其操作简单、可 重复、数据标准化,可广泛应用于医院感染菌的 快速检测分型。 3 细菌分子生物学检测技术 3.5 DiversiLab系统 例 :DivcrsiLab系统对医院感染的鲍曼不动杆菌进行同源性分析 3 细菌分子生物学检测技术 3.6 VNTR检测技术 可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR) 通 常 由 二 个 核 甘 酸 组 成 的 单 元 如 “ 胞 嘧 啶 + 腺 嘌 呤”(CA)经过若干次重复组成,由于重复的次数(即n值)是 可变的,因而构成一种多态类型。 VNTR是近年提出的概念,因其在基因组中分布极为丰富, 故应用日趋广泛。就某一VNTR而言,通常重复单元可以 表现出几次到几十次不同的重复,并由此决定不同的长度 类型,因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大。 3 细菌分子生物学检测技术 3.6 VNTR检测技术 例:单核细胞增生性李斯特菌检测分型 3 细菌分子生物学检测技术 3.6 VNTR检测技术 例:单核细胞增生性李斯特菌检测分型 3 细菌分子生物学检测技术 3.7 焦磷酸测序技术 在细菌鉴定分型的分子生物学方法中,能够提供 核酸碱基序列资料的分子检测技术成为细菌鉴定 分型的金标准。 焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短 片段DNA序列分析的方法,是一种依靠生物发光 进行DNA序列分析的技术。 3 细菌分子生物学检测技术 3.7 焦磷酸测序技术 例:焦磷酸测序技术检测沙门氏菌 4 展望 病原微生物的自动化系统 病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来 的前沿技术,在病原微生物的检测分型和预防控 制领域具有十分重要的应用价值。由于其所需样 品和剂量较少、快速省时、检测结果精确、自动 化操作程度较高,适宜用于食源性病原微生物的 检测与分型。 4 展望 病原微生物的自动化系统 目前,最有代表性的是AMS微生物自动分析系 统。该套系统含有14种检测卡片,每一种鉴定卡 片有25种以上的生化反应指标。操作时,先将一 定浓度的欲鉴定菌株菌悬液接种到各种细菌的小 卡上。仪器会自动检测最后由计算机判定,打印 出鉴定结果。 该技术在细菌的检测分型和预防控制领域具有 十分重要的应用价值。

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