全国咨询服务热线
400-0969235

当前位置
主页 > 新闻中心 >

细胞培养常见26个问题

发布日期:2021-05-16 14:27

  培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI- 1640做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基(SFM)

  加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

  L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

  GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。

  GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

  酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

  用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

  重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。

  高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

  1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

  2 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

  4 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

  丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

  GIBICO的胎牛血清 没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

  10.目录上说,Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

  HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在 CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

  Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:

  12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

  二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

  是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。

  14.我使用SF900 Ⅱ时,细胞生长良好,但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?

  如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。

  LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统),通过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。

  胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟,以消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)

  如果使用固体形式的培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

  18.室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?

  缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同的PH值。

  生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

  PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用,PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基,也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。

  24.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?

  可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。

  我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力最高。正如手册上所显示,通过使用巴氏德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。

  4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

  5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)

  使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。

  当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中,检测开始和支持ES细胞克隆的能力。

  当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中,检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。

  检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红,分化的细胞较大,丰满,颜色较浅。

  所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的,培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。)

  28.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗?

  通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候记数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,6up。细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。

  本网站所有注明“来源:生物谷”或“来源:bioon”的文字、图片和音视频资料,版权均属于生物谷网站所有。非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,否则将追究法律责任。取得书面授权转载时,须注明“来源:生物谷”。其它来源的文章系转载文章,本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,转载内容不代表本站立场。不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。温馨提示:87%用户都在生物谷APP上阅读,扫描立刻下载! 天天精彩!

  下载生物谷app,随时评论、查看评论与分享,或扫描上面二维码下载相关阅读

  癌症治疗新突破!日本京都大学团队利用iPS细胞培养出仅攻击癌细胞的定向“杀手T细胞”

  PLoSPathog:科学家开发出了能研究人类乳头瘤病毒感染机制的新型皮肤细胞培养技术

  杰科生物与赛多利斯全面开展细胞培养技术合作——强强联合助力中国精准医疗的腾飞

  Science:48年谜团终解决!利用人肠道细胞培养物成功地培养人诺如病毒

Copyright ©2015-2020 6up【真.正规】 版权所有 6up保留一切权力!